注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
?
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
Aniline blue water soluble癸二酸二乙酯 98%間甲酚  >99.0% (GC)

Toluidine blue O癸二酸二乙酯 standard for GC間甲酚  >98.0%(GC)

Toluidine bule癸 97%間甲酚 分析標(biāo)準(zhǔn)品

BTB癸 ≥95%, FCC, Kosher 2-甲基-3-胺 98%

Bromothymol blue sodium salt二氫 99%2-甲基-3-胺 分析標(biāo)準(zhǔn)品

Coomassie brilliant blue G250二氫 Kosher, FCC, ≥99%鹽酸芐絲肼 98%

Coomassie brilliant blue R250二芐 97%二甲硝咪唑 97%

MTT二芐 ≥98%, FCC4-羥基 98%

Trypan blue正癸酸 ≥98%, FCC, FG甲硝唑 分析標(biāo)準(zhǔn)品，>99.8%(GC)

Xylene cyale FF癸 natural, ≥92%甲硝唑 99%

Xylene blue庚酸乙酯 standard for GC, ≥99.5% (GC)2-溴-5-甲基噻吩 95%

Xylene cyale FF庚酸乙酯 CP,97%4-溴-2-甲基噻吩 98%

MTB庚酸乙酯 ≥99%, FCC, FG2-乙基噻吩 97%

Thymolphthalein庚酸乙酯 AR,98.5%2-羥基-5-硝基吡啶 98%

TPC辛酸乙酯 Standard for GC,>99%(GC)2-硫脲嘧啶 98%

Alizarin complexon辛酸乙酯 99%2-硫脲嘧啶 分析標(biāo)準(zhǔn)品

阿糖腺苷(標(biāo)準(zhǔn)品)PhosphoPlus® Chk2 (Thr68) Antibody DuetRelB  轉(zhuǎn)錄因子RelB蛋白抗體

氨芐西林/氨芐青霉素Pontin/RUVBL1 AntibodyRelB  核轉(zhuǎn)錄因子NFKB-RelB蛋白抗體

氨芐西林/氨芐青霉素(標(biāo)準(zhǔn)品)APC2 AntibodyRelaxin 1  松弛肽/松弛素抗體

(S)-1-氨基-3-甲基丁基酸蒎烷二酯三氟醋酸鹽Phospho-Chk1 (Ser317) (D12H3) XP® Rabbit mAbRegucalcin/SMP30  衰老標(biāo)記蛋白30抗體

阿替美唑鹽酸鹽Phospho-Chk1 (Ser317) (D12H3) XP® Rabbit mAbREG4/RELP  再生基因蛋白4抗體

阿替美唑鹽酸鹽(標(biāo)準(zhǔn)品)CIN85 (D1A4) Rabbit mAbReg3a  胰島β細(xì)胞生長因子抗體

硫酸阿托品/硫酸DL-莨菪堿Thap11/Ronin AntibodyReg3 gamma  胰島β細(xì)胞生長因子Reg IIIγ抗體

硫酸阿托品(標(biāo)準(zhǔn)品)CDX2 (D11D10) Rabbit mAbReg3 beta  胰島β細(xì)胞生長因子Reg IIIα 抗體

馬來酸阿扎他啶Phospho-mTOR (Ser2448) Blocking PeptideREG1β/REG1 beta  胰島細(xì)胞再生因子β抗體

鹽酸班布特羅(標(biāo)準(zhǔn)品)NKX2.2 AntibodyREG1A  胰島細(xì)胞再生因子ICRF抗體
圓弧青霉PCR檢測試劑盒規(guī)格人可溶性血纖蛋白單體復(fù)合物(SFMC)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：保存：-20℃100毫克

人可溶性粘附分子(Sam)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT，避光5克

人可溶性腫瘤壞死因子α受體(sTNFαR)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：100克

人可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(sTRAIL)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT50克

人可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(sTfR)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：25克

人克拉拉細(xì)胞蛋白(CC16)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：25毫升

人空腸彎曲菌黏附蛋白(PEB1)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：100克

人空泡毒素相關(guān)蛋白A(VacA)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1克
檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。